بررسی اثر بیان افزوده (overexpression) ژن p5cs بر برخی از پارامترهای فیزیولوژیکی و پروتئومیکس گیاهان تراریخت تنباکو(nicotiana tabacum cv. wisconsin) تحت تنش شوری در شرایط این ویترو

خشکی و شوری تنش های اسمزی و یونی مهمی می با شند که رشد گیاه و تولید محصولات کشاورزی را به طور جدی محدود می کنند. از جمله مکانیسم های سازگاری یا تحمل گیاهان به تنش شوری، افزایش اسمولیت هایی با وزن مولکولی پایین، از قبیل پرولین می باشد. پرولین علاوه بر اینکه به عنوان یک محافظ اسمزی عمل می کند، به عنوان یک منبع انرژی برای تنظیم پتانسیل های احیایی سلول می باشد و تصفیه کننده رادیکال های آزاد از جمله رادیکال های هیدروکسیل و اکسیژن یکتایی، نیز به شمار می آید. به همین دلیل پرولین به عنوان ماده ای قلمداد می شود که ماکرو مولکول ها، غشاها، پروتئین ها و ساختارهای درون سلولی را در مقابل تغییر ماهیت محافظت می کند. مسیر بیوسنتز پرولین در گیاهان مشخص شده است. آنزیم کلیدی در مسیر سنتز پرولین در گیاهان، p5cs می باشد. p5cs یک آنزیم دو عملکردی (bifunctional) می باشد که دو واکنش ابتدایی را در مسیر بیوسنتز پرولین در گیاهان کاتالیز می کند. در این مطالعه اقدام به تولید گیاهان تراریخت حاوی ژن p5cs گردید. cdna مربوط به ژن p5cs از گیاه moth bean تحت پروموتور ca mv 35s ساخته شده و توسط باکتری آگروباکتریوم تومی فاسینس در سلول های گیاهی تنباکو انتقال یافت. اثبات گیاهان تراریخت از طریق آزمایشات pcr و با استفاده از پرایمرهای nptii و p5cs صورت گرفت. گیاهان تراریخت و غیرتراریخت تنباکو در محیط های کشت ms حاوی غلظت های 0، 150، 250، 300 و 400 میلی مولار نمک طعام به مدت 4 هفته کشت داده شدند و خصوصیات فیزیولوژیکی مختلف در دو گیاه تراریخت و غیرتراریخت تنباکو تحت تنش شوری در شرایط در شیشه مورد مطالعه قرار گرفت. گیاهان تراریخت تحمل بیشتری نسبت به شوری نشان دادند و قادر به رشد در غلظت های بالای nacl بودند، در حالی که گیاهان غیرتراریخت در غلظت 300 و 400 میلی مولار nacl به شدت نکروزه شدند و میزان رشد آنها شدیداً کاهش پیدا کرد. در ریشه ها و برگ های هر دو گیاه تراریخت و غیرتراریخت با افزایش غلظت nacl در محیط، افزایش معنی داری در میزان پرولین نسبت به گیاهان شاهد مشاهده شد ولی در گیاهان تراریخت، میزان پرولین در تمام غلظت های nacl افزایش معنی داری نسبت به گیاهان غیرتراریخت نشان داد. اندازه گیری پرولین در زمان های مختلف پس از شروع تنش شوری در غلظت 300 میلی مولار nacl، نشان داد که در برگ و ریشه گیاهان تراریخت و غیرتراریخت بلافاصله پس از آغاز تنش شوری میزان پرولین به تدریج افزایش پیدا کرده و به ماکزیمم مقدار در 24 و 48 ساعت رسید. میزان نسخه برداری ژن p5cs ترانس ژن و p5cs بومی یا اندوژن گیاه تنباکو توسط آزمایشات rt-pcr در گیاهان تراریخت و غیرتراریخت تنباکو بررسی شد. میزان نسخه های p5cs ترانس ژن در گیاهان تراریخت پس از القای تنش شوری افزایش یافته و در زمان 24 و 48 ساعت پس از تنش، تفاوت معنی داری نسبت به گیاه شاهد نشان داد، در حالی که در زمان 4 ساعت تفاوت معنی دار مشاهده نشد. مقدار پرولین آزاد، کلروفیل، قندهای محلول، میزان پتاسیم و فعالیت آنزیم های کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز تحت تنش شوری در گیاهان تراریخت به طور معنی داری بالاتر از گیاهان غیرتراریخت مشاهده شد. می توان بیان کرد که گیاهان تراریخت با افزایش بیان ژن p5cs و تولید پرولین بیشتر توانسته اند از ویژگی های خاص پرولین درتطابق اسمزی و همچنین حفظ ساختارهای سلولی و آنزیمی بهره گیرند و تحمل بیشتری به تنش شوری نشان دهند. نتایج sds-page در هر دو جدا کشت برگ و ریشه نشان داد که الگوی پروتئین های گیاهان شاهد با گیاهان تحت تنش تفاوت داشته، ضمن این که تفاوت آشکاری از نظر برخی باندها بین گیاهان تراریخت و غیرتراریخت مشاهده گردید. جهت بررسی های پروتئومیکس، پروتئین ها از برگ های گیاهان تنباکو تیمار داده شده با غلظت 0 و 150 میلی مولار نمک استخراج شد و سپس با استفاده از الکتروفورز ژل پلی اکریلامید دو بعدی جدا گردیدند. میزان بیان 8 پروتئین تحت تنش شوری در مقایسه با شاهد تغییر معنی داری نشان دادند. پروتئین هایی که در برگ تنباکو تحت تأثیر تنش شوری قرار گرفتند شامل پروتئین های درگیر در واکنش های فتوسنتزی، دفاعی، متابولیسمی می باشند، از جمله زیرواحدهای بزرگ و کوچک روبیسکو، oee، ppars (peroxisome- proliferator- activated receptor ) پروتئین stromal 70- kda heat shock، sod (superoxide dismutase) و β atp. در مورد ریشه نیز بررسی های پروتئومیکس نشان داد 15 پروتئین به طور تکرارپذیری در ریشه های تنباکو تحت تنش شوری، افزایش و یا کاهش بیان پیدا کردند که 6/26 درصد از این پروتئین ها افزایش بیان نشان دادند و 4/73 درصد کاهش بیان داشتند.